SLAMseq代谢标记试剂盒



标准的RNA-seq方法可以评估总RNA丰度,但不能解决RNA转录和降解整体动态水平的动力学问题。SLAMseq系列产品以时间作为RNA-Seq的一个新维度,能同时对新合成的和已有的RNA进行定量分析。

 


产品优势
可进行转录组--RNA合成及降解的动力学分析;
获取控制基因表达的新见解;
建立刺激诱导的RNA转录和降解之间序列改变的模型;
通过比较新生转录水平,显著提高差异表达的分辨率;
只需向RNA-Seq工作流添加两个步骤,无需pull-down实验或生化隔离;
对于时间分辨的RNA-seq,整合了Lexogen’s SLAMseq标记试剂盒,QuantSeq3’mRNA-Seq文库构建试剂盒,以及SLAMdunk分析软件。

 


工作流程
SLAMseq系列产品是基于一种新的全转录组定量、快速和可靠的标记方法:通过硫醇(SH)烷基化标记用于RNA的代谢测序1。用核苷酸类似物4-硫代嘌呤(4-Thiouridine,S4U)与细胞孵育,S4U被细胞摄入,并整合到新转录的,新生的RNA中。该工作流程的关键特点是烷基化步骤,使用碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)修饰S4U核苷酸,导致核苷酸在逆转录过程中发生转化。因此,S4U标记的转录本,在测序读取过程中,会导致胸腺嘧啶变成胞嘧啶(T>C)。通过生物信息学分析T>C reads数,量化新合成的RNA水平(Fig.1)。使用SLAMseq,可以从单个总RNA样本并行地分析新生和总RNA水平。对于时间分辨基因表达研究,SLAMse(标记)、QuantSeq(建库)以及SLAMdunk(数据分析)是最佳的搭配组合。

Figure 1 | SLAMseq工作流示意图。培养的细胞用4-硫代嘌呤(S4U)标记新生RNA(绿色)。抽提纯化Total RNA,并加入碘乙酰胺(IAA)诱导4-巯基烷基化。用QuantSeq 3’ mRNA-Seq文库构建试剂盒进行文库构建,在反转录过程中,S4U位点会反转录成鸟嘌呤 (G,红色)而不是腺嘌呤(A,黑色)。因此,在随后的数据分析过程中,可以通过T>C突变信息区分已有的RNA和新合成的RNA。

 


SLAMseq 试剂盒
从S4U标记条件的优化到进行S4U标记动力学实验,以及后续的RNA提取和烷基化,SLAMseq试剂盒为RNA代谢测序实验提供了一个完整的解决方案。(Tab. 1 和 Tab. 2).

 

产品应用
测定RNA合成及降解速率用S4U标记小鼠胚胎干细胞,随后抽提出总RNA,烷基化,用QuantSeq 3’mRNA试剂盒进行文库构建和测序。首先,用S4U标记mESCs 24小时,然后用未标记的尿苷进行冲洗和尿苷终止反应(U终止反应)。测序数据用SLAMDUNK软件进行分析,测定整个转录组
的RNA周转率。Fig.2显示了两个基因合成与降解的典型动力学实验数据。转录因子HES1具有高的周转速率(RNA合成与降解速率高),而对于管家基因NDUFA7,它的周转速率较低。

Figure 2 | S4U标记动力学实验揭示个体RNA合成与降解的速率。测定RNA的合成速率,用S4U(100 μM)处理 24小时;测定RNA的降解速率,用S4U饱和处理细胞,然后去除S4U并且添加未标记的尿苷(U Stop)进行测定。

 


新转录RNA及总RNA差异表达谱并行分析
SLAMseq可以在同一个样本中同时分析总RNA及新转录RNA的表达情况。为阐明常规、稳态RNA测序和SLAMseq代谢RNA测序之间的差异,Muhar等人在人细胞系中做了基因差异表达分析(Muhar et al., 2018)。SLAMseq可显著提高基因差异表达检测和定量的灵敏度(Fig. 3A)。SLAMseq可分析新合成mRNA水平来揭示抑制剂处理对转录的反应,而常规RNA-Seq却不行(Fig.3B)。因此,SLAMseq是揭示细胞反应潜在机制和药物发现研究的理想选择。

 


SLAM-ITseq: 确定哺乳动物体内特定组织和细胞类型的基因表达
对于该应用,将4-硫尿嘧啶(4-Thiouracil,不是LAMseq中的S4U)注射到转基因生物体中,例如仅在特定细胞类型中表达尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)的小鼠中,新合成RNA仅在该细胞类型中被标记,然后提取纯化RNA,最后进行标准SLAMseq分析。可根据RNA -seq数据中碱基的转换信息,对体内特定组织和细胞类型的基因表达进行定量(Matsushima et al.,2018)。 SLAMseq合成代谢动力学试剂盒模块包含SLAM-ITseq所需的组分(4-Thiouracil除外),同时SLAMdunk软件与SLAM -ITseq数据兼容,可对其进行分析。

 


SLAM-ITseq:监 测体内RNA的运输
组织特异性表达的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)和基于4-Thiouracil标记的RNA也可用于监测组织间RNA的运输 (Sharma et al., 2018).

 


SLAMdunk – SLAMseq数据分析软件
Lexogen可以为客户提供对SLAMdunk1的访问,可定制化分析来自QuantSeq 3'mRNA-Seq文库的SLAMseqRNA-Seq数据。用户在Bluebee®Genomics平台上使用SLAMdunk软件可以很容易的对SLAMseq实验数据进行分析。只需上传压缩的fastq文件并选择适当的物种即可。处理数据之后,SLAMdunk可获得T> C转换率统计数据,以及比对到3'UTR区域的统计数据,然后可以从Bluebee®平台下载结果。 SLAMseq,QuantSeq和SLAMdunk为高通量时间分辨RNA-Seq实验提供了完整且友好的解决方案。

References
1. Herzog, V., et al. (2017) Nature Methods, DOI: 10.1038/nmeth.4435
2. Muhar, M., et al. (2018) Science, DOI: 10.1126/science.aao2793.
3. Sharma, U., et al. (2018) Developmental Cell, DOI: 10.1016/j.devcel.2018.06.023
4. Matsushima, W., et al. (2018) Development, DOI: 10.1242/dev.164640
5. Lexogen GmbH (2017) SLAMseq Explorer and Kinetics Kits – User Guide, Pub. No 059UG142V0103.

Figure 3 | SLAMseq提高基因差异表达灵敏度检测。A) BCR / ABL抑制剂处理组(尼洛替尼)与DMSO对照组相比,K562细胞新合成RNA(T>C转换reads,绿色显示)水平显示出比总mRNA(灰色)更高的变化倍数。B)新合成mRNA(绿色)与总mRNA水平(灰色)对比分析,前者检测到更多的差异表达基因。图片来源于 Muhar et al, 2018.


说明书附件下载:

SLAMdunk分析软件说明                      

 

SLAMseq RNA代谢标记试剂盒说明书

 

SLAMseq-MSDS文件                     

 

SLAMseq代谢标记试剂盒

SLAMseq代谢标记试剂盒 标准的RNA-seq方法可以评估总RNA丰度,但不能解决RNA转录和降解整体动态水平的动力学问题。SLAMseq系列产品以时间作为RNA-Seq的一个新维度,能同时对新合成的和已


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