由含受损 DNA 的样本构建 NGS DNA 文库

xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒能够由受损样本制备文库，这类样本的序列信息较难获得。xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒可以在 2 小时内由 10 pg 的起始材料中构建文库。通过使用 IDT Adaptase 技术，可以由严重受损的样本制备文库。与其他文库制备方法不同，Adaptase 技术由单链 DNA 片段生成文库分子，与适用于 Illumina® 平台的其他市售产品相比，该技术可以更好地从严重切割和降解的样本中恢复其样本起始 DNA 的复杂度。样本类型包括降解的 FFPE、古代 DNA、染色质免疫沉淀 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 和其他 DNA 受损的富集样本。

从含有 ssDNA 的低丰度样本中获取有价值的测序数据

xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒专为需要在研究中对含有 ssDNA 的样本进行测序的用户设计。包括宏基因组和病毒组样本，其中可以确定 ssDNA 和 dsDNA 噬菌体以及病毒基因组的相对丰度。其他兼容的样本类型包括热变性致病性样本、在恶劣变性条件下提取以减少提取偏差的样本，以及需要检测单链 cfDNA 含量时的肿瘤相关液体活检样本。

表1 技术参数

产品优势

• 低起始量、高复杂度——高度降解样本低至 10 pg 的起始量

• 与 ssDNA 和 dsDNA 样本兼容——保留起始片段化模式以精确比对 DNA 插入片段末端

• 充分减少源自 PCR 的序列偏倚——高保真 PCR 聚合酶，特有的化学法适用于长度 ≥40 bp 的短 DNA 片段

• 可对多达 1536 个样本进行混样——预铺板 UDI 引物支持对多达 1536 个样本进行混样

• 兼容 xGen NormalaseTM 技术——在单个文库池中对文库进行酶学均一化

• 实验方案简单高效，只需 2 小时即可完成

• 精心设计的工作流程，轻松实现自动化

应用方向

• 宏基因组学研究

• 病毒基因组学研究

• 较难提取的微生物研究

• 热变性致病菌研究

建库流程

该试剂盒的工作流程如图 1 所示。如图所示，样本经历了四个步骤：

Adaptase 技术——Adaptase 反应以高效、不依赖模板的方式，同时进行 3´ 端加尾和 R2 短接头连接。

延伸——延伸反应在连接之前生成第二条链。

连接——连接反应将 R1 短接头添加到原始链上。

加标签 PCR——PCR 用于引入 Illumina® 测序所需的样本标签和序列。标签引物单独提供。

图 1. xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒的工作流程。

产品数据

ssDNA 和 dsDNA 噬菌体的相对丰度

xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒用于制备和测序三个人工病毒组，病毒组中含有按不同比例混合的 ssDNA 噬菌体（PhiX174 和 M13）与 dsDNA 噬菌体（图 2）。在本实验中，所有情况均支持在使用 xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒测序时，之前无需进行任何用于识别 ssDNA 噬菌体的全基因组扩增，相应比例得到了保留。

使用 v2 化学法和 101 双端 read 在 Illumina® MiSeq® 上对文库进行测序。然后用 bowtie2 比对 read，以评估每种病毒的相对丰度，定义为按基因组大小归一化后比对上的 read 数。然后将这些病毒组丰度值与 AVC 中每个基因组的拷贝数进行比较，dsDNA 噬菌体通过 SYBR® Green 计数进行估计，ssDNA 噬菌体根据用 NanoDrop®（赛默飞世尔）读数测定的 DNA 数量进行计算。与 ssDNA 病毒的单个潜在模板相比，dsDNA 噬菌体的预期丰度增加了一倍，可以校正两种 DNA 分子的占比，这两种 DNA 分子可以作为潜在模板。

图 2. 文库由 ssDNA 和 dsDNA 噬菌体混合样本制备而来。通过将从两种 ssDNA 噬菌体（M13 和 PhiX174）中分离的 gDNA 与从八种 dsDNA 噬菌体（SPM2、10-94a、H100/1、H7/2、38:2、38:1、18:3 和 18:1）中分离出的 gDNA 以不同比例的 ssDNA 与 dsDNA 混合，制备了三个人工病毒群落 (artificial viral community, AVC)。AVC A 含有 50% 的 ssDNA 和 50% 的 dsDNA 噬菌体，AVC B 含有 10% 的 ssDNA 和 90% 的 dsDNA 噬菌体；AVC C 含有 90% 的 ssDNA 和 10% 的 dsDNA 噬菌体。根据生产商的说明，使用 M220 Covaris® 剪切仪将 AVC 剪切至 200 bp，并使用 xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒构建 NGS 文库。

一种 DNA 难以提取的微生物的 DNA 提取和测序

图 3A 和 B 中的数据显示了 Facklamia sp. 的 DNA 提取和测序后的结果，Facklamia sp. 是一种公认的 DNA 提取较困难的微生物。Facklamia sp. HGF4 的纯培养物生长至 2 x 109 CFU/mL。之所以选择 Facklamia sp. HGF4，是因为它是一种难以使用非变性珠打提取法提取其 gDNA 的革兰氏阳性分离株。由于 Facklamia sp. HGF4 没有参考基因组，需要从头组装测序输出。将细菌培养物分成两个等分，一个用珠打法从中分离 gDNA，另一个用变性 NaOH 煮沸法从中提取 gDNA。随后通过离心让 1 mL 2 x 109 CFU/ml 细菌形成颗粒，去除上清液，将细胞重悬在 50 µL 无菌水中。然后，向细菌悬液中加入 50 µL 0.1 N NaOH，通过涡旋混合样本，然后在 95 °C 下煮沸 15 分钟。然后在冰上冷却溶液，并加入 8 µL Tris-HCl（pH 7.0）进行中和。将样本以 15,000 x g 的离心力离心两分钟，以使细胞碎片和所有未裂解的细胞形成颗粒，然后将上清液转移到新的反应管中。用异丙醇沉淀分离的 gDNA 以清洁并浓缩样本。通过 Qubit®（赛默飞世尔，dsDNA）和 NanoDrop (ssDNA) 对 DNA 进行定量。文库使用 xGen ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒制备而成。使用 MIRA 4.0 对 Facklamia sp. HGF4 从头进行组装，并使用 RAST 服务器加以注释。

图 3. 一种 DNA 难以提取的微生物的 DNA 提取和测序。 (A) 通过 NaOH 煮沸法从 Facklamia sp. 中提取的 DNA 比珠打法产生的 DNA 得率要高，且所用时间更短。(B) 对 NaOH 提取的 DNA 进行测序，产生了一个全面的、从头组装的基因组序列，该序列与珠打法提取的 DNA 产生的序列一样。

订购信息