Affinity Plus™ qPCR 探针

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含锁核酸饰的Affinity Plus qPCR探针的优势

锁核酸碱基，如Affinity Plus单体，可以被整合到有效的qPCR探针中[1-4]。由于锁核酸碱基显著提高了Tm值，Affinity Plus qPCR探针可以设计得比标准qPCR探针更短。较短的探针比未修饰的长探针有更好的猝灭效果和更高的信噪比。更重要的是，锁核酸探针提供了改进的能力来区分突变或单核苷酸多态性（SNPs）[1]。Affinity Plus qPCR探针可以设计包含多个锁核酸单体，从而实现Tm值大于15°C，这极大地提高了实时PCR或其他使用差异杂交来区分多态性的实验中的等位基因测定的准确性。

 

 

设计考虑事项

● 取决于核酸序列，每个锁核酸碱基插入到DNA寡核苷酸中可以将Tm值提高3-6℃。多个锁核酸的添加可以导致Affinity Plus qPCR探针Tm值大于15℃。

 

● Affinity Plus锁核酸碱基的相对结合亲和力（Tm）顺序为：Affinity Plus:Affinity Plus > Affinity Plus:DNA > DNA:DNA。因此，必须检查探针序列中是否有二聚体和发夹结构的形成，尽量减少会造成 Affinity Plus:Affinity Plus 配对的设计。

 

●

在Affinity qPCR探针中添加多达6个Affinity Plus锁核酸碱基

 
  ○

应将Affinity Plus锁核酸碱基放置在SNP位点以及相邻的每个碱基上。如果可能，SNP应该定位在探针的中心。避免将Affinity Plus锁核酸碱基放置在探针序列的第一个或最后一个碱基上。

 
  ○

可以根据需要额外添加Affinity Plus锁核酸碱基以调整Tm值。我们建议连续放置不超过4个Affinity Plus锁核酸碱基。

 
  ○

Affinity Plus锁核酸碱基的放置取决于序列，并且可能需要优化以达到匹配和不匹配之间理想的Tm值。

 

● 对于标准qPCR，推荐使用高达150 bp的扩增子大小。对于数字PCR（dPCR）或含有缩短片段样本（如FFPE或小循环DNA样本）的应用，通常推荐使用80-100 bp的较短扩增子。

 

 

产品优势

 

● 可选择包括FAM、Yakima Yellow® (YAK)、SUN™、HEX、Cy® 3、Cy® 5、TEX和TYE™染料在内的荧光基团。

● 与传统 qPCR 探针相比错配鉴别力更高

● 这种方法经济合宜，帮助您提高分析试剂杂交特异性

● 灵活调整Tm值

● 可选择Mini Affinity Plus qPCR探针用于筛选小样本集。

 

 

产品数据

 

增强序列稳定性

含有Affinity Plus锁核酸核苷酸的序列与其他制造商的锁核酸序列具有相同的退火特性（图1）。锁核酸碱基的引入增加了杂交亲和力、熔解温度（Tm），并在体外和体内增强了序列稳定性。

 

图1. 含有Affinity Plus的序列显示出与其他制造商的锁核酸序列相同的退火特性。图中绘制了解离的双链碱基对百分比和温度的函数关系。15-mer序列GGTCCT+T+A+CTTGGTG，在+T、+A和+C位点整合Affinity Plus或其他锁核酸修饰。这些寡核苷酸与互补的DNA链（每条链1 µM）在1 M Na+缓冲液（pH 7）中混合。熔解曲线分析按照Owczarzy等人[2]的描述进行。解离双链碱基对图是平均了至少 7 个加热和冷却解链曲线得出的。测得Affinity Plus寡核苷酸的熔解温度为67.7 ± 0.3°C，其它锁核酸寡核苷酸的熔解温度为67.9 ± 0.3°C。在37°C下双链杂交的自由能分别为：Affinity Plus寡核苷酸-18.1 ± 0.9 kcal/mol，其他锁核酸寡核苷酸为-18.7 ± 0.9 kcal/mol。这些结果证明了两种来源的锁核酸序列具有相同的退火特性。

 

 

 

锁核酸探针在 qPCR 分析中的优势

与未修饰的探针序列相比，Affinity Plus qPCR探针具有更高的熔解温度，并且在针对低GC含量区域的qPCR检测中更加稳定。增加的稳定性也使得使用较短的探针设计成为可能，这在目标区域尺寸有限时是理想的。图2展示了Affinity Plus qPCR探针与PrimeTime™ qPCR锁核酸探针具有相同的扩增特性，两者与未修饰的DNA探针相比都显示出更快的目标扩增速度。

 

 

图2. Affinity Plus qPCR探针与PrimeTime锁核酸qPCR探针生成相同的扩增数据。设计了一个定制的PrimeTime qPCR检测来检测人类呼吸道合胞病毒A型中的M2-2基因。使用gBlocks基因片段作为目标模板，比较了两种锁核酸qPCR探针[17个碱基的探针，含有7个锁核酸单体，位置相同，分别作为Affinity Plus qPCR探针或PrimeTime锁核酸qPCR探针制造（Tm = 68.1°C）]与未进行锁核酸修饰的相同DNA序列（Tm = 49.9°C）的性能。(A) 使用这3个探针的扩增曲线显示，Affinity Plus和PrimeTime锁核酸qPCR探针产生相同的结果。(B) 比较在有（gBlocks™基因片段）或无（NTC）模板的反应中的阈值循环（Cq）值。两种含有锁核酸核苷酸的探针都能特异性地扩增模板。NTC = 无模板对照。

 

 

附件

 

Affinity Plus qPCR Probes 

 

 

参考文献

 

1. Davalieva K, Kiprijanovska S, Plaseska-Karanfilska D. Fast, reliable and low cost user-developed protocol for detection, quantification and genotyping of hepatitis C virus. J Virol Methods. 2014;196:104-112.

2. Owczarzy R, You Y, Groth CL, et al. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 2011;50(43):9352-9367.

3. You Y, Moreira BG, Behlke MA, et al. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006;34(8):e60.

4. Johnson MP, Haupt LM, Griffiths LR. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2004;32(6):e55.