T7EI检测工作原理

● 用 PCR 扩增目标基因组区域。

● 在热循环仪中对 PCR 产物进行变性和退火，可让野生型 DNA 和 CRISPR 突变型 DNA 形成异源双链。

● 用 T7EI 消化重新退火的 PCR 产物，切割错配的异源双链 DNA。

● 使用凝胶和毛细管电泳分析结果。

针对 T7EI 检测的 PCR 设计技巧

设计 PCR 引物，扩增您的实验目标位点和相邻序列。我们建议使用长度为 600–1000 bp 的PCR扩增子，并且CRISPR切割位点每侧至少有100 bp的侧翼序列。使 CRISPR切割位点偏离中心，以便在凝胶上形成2个不同的消化产物条带尺寸。仔细优化PCR条件，并通过电泳确认在编辑之前从基因组DNA 中扩增了单个 PCR 产物。如需 PCR 设计帮助，请使用PrimerQuest™工具（www.idtdna.com/PrimerQuest）。 

图1 T7EI 检测示意图。

产品优势

T7 核酸内切酶I (T7EI) 错配切割分析可检测中靶基因组编辑，并估计 CRISPR 处理细胞中的基因组编辑效率。

● 直接——使用标准分子生物技术

● 快速——在分析前无需对 PCR 产物进行纯化

● 一致——电泳分析结果直观易读

● 可量化——凝胶条带强度反映基因组编辑效率

● 多功能——可对单个样本进行检测，也可对平板进行高通量分析

产品数据

CRISPR 实验中的突变检测：Alt-R 基因组编辑检测试剂盒与靶向二代测序的比较

Alt-R 基因组编辑检测试剂盒，一种 T7EI 错配核酸内切酶检测，能很好地估计基因组编辑效率。然而，由于 T7EI 核酸内切酶无法识别单碱基插入和删除，因此，与二代测序 (NGS) 相比，这种方法会低估编辑效率。T7EI 检测低估编辑效率的量因靶标而异，与Cas9切割后非同源末端连接（NHEJ）介导的修复事件有关。

图 2. T7 核酸内切酶 I实验提供了基因组编辑效率的良好预估，但与二代测序（NGS）结果相比，会低估基因组编辑效率效率。 Alt-R CRISPR-Cas9 RNA 寡核苷酸 (30 nM) 通过脂质体转染导入稳定表达化脓性链球菌 Cas9 的 HEK-293 细胞中。靶向 8 个基因中每个基因的 3 个PAM位点。使用 Alt-R 基因组编辑检测试剂盒（深蓝色柱）检测转染细胞中的基因组 DNA 样本，以估计编辑效率，该试剂盒中提供了进行 T7EI 检测所需的试剂。还使用靶向 NGS（浅蓝色柱）对同一 DNA 样本进行了分析。扩增子在 MiSeq® 系统 （Illumina） 上运行，并使用公开可用的数据处理程序分析数据。误差线表示三份脂质转染实验（技术重复）的标准偏差。（每个基因靶位置 n = 1）

阳性对照：T7EI 突变切割分析

Alt-R 基因组编辑检测试剂盒中的对照品 A 和 B 为 T7EI 检测提供了有力对照，可证明这项检测可正常运行。对照品 A 和 B 的全长 PCR 片段分别为 692 bp 和 686 bp。T7EI 消化产物约为 436 bp 和 256 bp。

图 3. 在Fragment Analyzer™系统上获得的T7EI突变切割实验的易读结果。使用 KAPA HiFi 高保真热启动 DNA 聚合酶 (Kapa Biosystems)，用对照品 A 和 B 中的模板和引物（Alt-R 基因组编辑检测试剂盒）进行 PCR 检测。扩增条件为 95°C 下 5 分钟；30 x（98°C 下 20 秒，64°C 下 15 秒，72°C 下 30 秒）；72°C 下 2 分钟。在热循环仪中对 PCR 产物进行变性和重新退火（95°C 下 10 分钟；95–85°C（变温速率为 –2°C/秒）；85–25°C（变温速率为 –0.3°C/秒）。样本 1 中包含对照品 A 的 PCR 产物，而样本 2 中包含对照品 A 和 B PCR 产物中的同源双链和异源双链。在 37°C 下，用 2 U T7EI 对重新退火的 PCR 产物消化 60 分钟。在 Fragment Analyzer 系统 (Advanced Analytical Technologies, Inc.) 上对消化反应进行分析。描绘图（左）显示了样本 2 的结果。凝胶图（右）显示了样本 1 和样本 2 的结果。LM = lower marker; UM = upper marker (n = 1).

阳性对照：CRISPR 编辑（人、小鼠或大鼠 HPRT）

阳性对照实验的结果对于研究发表来说非常重要，并且会提供有用的信息，帮助您解决实验中遇到的问题。

通过使用Alt-R HPRT阳性对照gRNA（针对人类、小鼠或大鼠），确认您的CRISPR编辑条件是否有效。我们为Alt-R CRISPR-Cas9和Alt-R CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统提供不同的阳性对照gRNA。

为了追踪您的阳性对照样本中的基因组编辑，使用Alt-R基因组编辑检测试剂盒和CRISPR对照引物混合液（针对人类、小鼠或大鼠）。对照PCR引物可用于 Alt-R CRISPR-Cas9 或 Alt-R CRISPR-Cas12a (Cpf1) 系统。

图 4. 来自Alt-R CRISPR HPRT阳性对照的T7EI消化样本数据。被CRISPR-Cas9（A）和CRISPR-Cas12a（Cpf1）（B）编辑的人类、小鼠和大鼠HPRT对照的基因组DNA被PCR扩增，使用T7内切酶I消化，并在Fragment Analyzer系统上运行。 (Advanced Analytical Technologies, Inc.). 使用 5000 bp（上标记）和 35 bp（下标记）的标准品条带校准凝胶并分析结果。表中列出了切割和未切割阳性对照扩增子的估计条带大小。所用的细胞系为 HEK-293（人）、Hepa1-6（小鼠）和 RG2（大鼠）。人类和小鼠引物的PCR退火温度为67°C，而大鼠引物的退火温度为64°C（n = 1）。

阴性对照：CRISPR 基因组编辑

在 T7EI 检测中，用您的实验引物和循环条件扩增阴性对照孔，应仅生成全长产物。

在您的编辑实验中使用 Alt-R CRISPR-Cas9 阴性对照 crRNA #1、#2 或 #3 可支持得出以下结论，即 T7EI 检测中的切割产物来自 Cas9 对特定靶点的识别和切割，而与其他转染或电穿孔相关因素无关。注：Alt-R CRISPR-Cas9阴性对照crRNA #1、#2和#3通过计算机设计，确保它们与人类、小鼠和大鼠基因组靶标没有同源性。

IDT科学家还为人类、小鼠和大鼠细胞中的Alt-R CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统计算设计并测试了阴性对照导向RNA。

订购信息

CRISPR Genome Editing Detection Kits

CRISPR Control Primer Mixes