IDT 致力于为研究人员提供优质产品，供其用于前沿的科学探索。xGen 猴痘病毒扩增子探针组是作为IDT二代测序 (next generation sequencing, NGS) Tech Access计划的一部分而设计推出的，该计划旨在让客户能够及早使用我们的先进研究工具，从而加速创新的步伐。Tech Access产品尚未完成我们标准、严格的开发周期。这些产品尤其适合需要新型技术以解锁新发现的研究人员。

当前流行的猴痘变异株具有含近 200 kb 双链 DNA 的基因组。吸取 COVID-19 大流行的经验教训，对病毒和任何潜在突变进行监测得到了国际支持。IDT xGen 猴痘病毒扩增子探针组有助于研究人员通过二代测序追踪猴痘毒株，包括潜在的新变异株。

表1. xGen 猴痘病毒探针组的技术参数。

工作流程

2.5 小时内即可完成从 DNA 到测序文库的制备流程

xGen 猴痘病毒扩增子探针组的工作流程采用提取的病毒 DNA（图 1）。然后，您可以使用专门靶向 184 kb 猴痘基因组的平铺引物对，在单管中生成 NGS 文库。这些引物是专门为当前流行的猴痘毒株（NCBI 检索号 ON568298 [1]）设计的，支持您在 PCR 1 + PCR 2 的单管工作流程中生成重叠的扩增子。如果将多个样本混合在一起进行 NGS，xGen 扩增子核心试剂盒包含用于 Normalase™ 技术的试剂，即专有的酶学均一化步骤，可减少手动均一化所需的动手操作时间。

图 1. xGen 猴痘病毒扩增子探针组工作流程。 通过三个主要步骤由病毒样本制备双标签文库：1) 多重 PCR，2) 接头连接和加标签 PCR，以及 3) 可选的 Normalase™ 步骤，生成等摩尔浓度文库池。

产品优势

xGen 猴痘病毒扩增子探针组支持：

• 对位点 6760–190,905（不包括 ITR）的全面覆盖

• 可在低至 300 个病毒基因组拷贝的病毒滴度下获得序列数据

• 单管工作流程

• 约 2.5 小时内即可完成从病毒 DNA 到测序文库的制备流程

• 多达 1536 对 UDI

• 超级扩增子技术

产品数据

随着最近全球猴痘病毒感染的出现，各地对快速、可靠 NGS 方法的需求急剧增加，需要其不仅能监测和追踪疫情，还要能追踪可能出现的任何潜在新型变异。目前正在进行流行病学研究，以查明这种人畜共患疾病的传播和感染模式。IDT 了解这些研究的重要性，设计了一款针对猴痘病毒的 xGen NGS 扩增子测序探针组†。

xGen 猴痘病毒扩增子探针组为研究猴痘病毒 (monkeypox virus, MPXV) 提供了一个精简的（2.5 小时内即可完成从 DNA 到测序文库的制备流程）单管 NGS 工作流程。该预设计 xGen 扩增子探针组在低至 300 个病毒基因组拷贝的起始量下（表 3），提供对 184 kb 猴痘基因组的高质量覆盖（表 2、图 2 和图 3）。xGen 扩增子技术包括扩增子堆叠和超级扩增子创建，以确保全面的基因组覆盖，并且能够应对未来可能发生在引物结合位点的病毒突变（图 4），从而支持在未来识别新型变异。

图 2. 对猴痘病毒基因组的覆盖。 作为全面覆盖猴痘 (DQ011157) 特定位点的一个例子，将约 3000 个拷贝的猴痘基因组（BEI Resources，NIAID，NIH：猴痘病毒 USA-2003，NR-4928 的基因组 DNA）和 10 ng Coriell DNA NA12878（人）投入使用 xGen 猴痘病毒扩增子探针组的 xGen 扩增子工作流程。在 MiSeq 系统 (Illumina) 上，使用 250 bp 双端 (PE) 测序对所得 NGS 文库进行测序，生成 3,055,632 总 read。使用 bwa (v 2.2.1 [3]) 将 read 与猴痘参考基因组 (DQ011157 [2]) 进行比对。然后绘制每个基因组位点的总测序深度（按 log10 的标度规格），以可视化基因组覆盖。这里显示了一个复样的示例数据，但实验重复显示了类似的结果。

覆盖和中靶比对率

根据最初的研究和开发，该探针组已被证明能够从位点 6760–190,905 全面覆盖猴痘病毒基因组。由于这些序列的重复性，探针组设计中去除了基因组两端的反向末端重复序列 (inverted terminal repeat, ITR)。

为了使用 xGen 猴痘病毒扩增子探针组制备扩增子测序文库，使用了约 3000 个拷贝的猴痘基因组 (BEI Resources) 和 10 ng Coriell DNA NA12878（人）。在 MiniSeq™ 系统 (Illumina) 上，使用 150 bp 双端 (PE) 测序对所得 NGS 文库进行测序，生成 1,774,058 总 read。使用 bwa (v 2.2.1 [3]) 将 read 与猴痘参考基因组 (DQ011157 [2]) 进行比对。表 2 显示了在这个概念验证实验中获得的代表性指标。

表 2. xGen 猴痘病毒扩增子探针组 NGS 指标。

图 3. xGen 猴痘病毒扩增子探针组可全面覆盖猴痘基因组（不包括 ITR）。 为了使用 xGen 猴痘病毒扩增子探针组制备扩增子测序文库，使用了约 3000 个拷贝的猴痘基因组（BEI Resources，NIAID，NIH：猴痘病毒 USA-2003，NR-4928 的基因组 DNA）和 10 ng Coriell DNA NA12878（人）。在 MiniSeq 系统 (Illumina) 上，使用 150 bp 双端 (PE) 测序对所得 NGS 文库进行测序，生成 1,774,058 总 read。使用 bwa (v 2.2.1 [3]) 将 read 与猴痘参考基因组 (DQ011157 [2]) 进行比对。所示散点图表示探针组中每个扩增子的相对覆盖度 (n = 4)，每个扩增子用一个蓝点表示。彩色虚线表示 0.05X、0.1X、0.2X、1X 和 5X 的平均覆盖度。

在低至 300 个病毒基因组拷贝的滴度下的测序结果

xGen 猴痘病毒扩增子探针组的起始材料包括 3000、300 或 0 个拷贝的猴痘基因组 (BEI Resources) 和 10 ng Coriell DNA NA12878（人）。如上所述对所得 NGS 文库进行测序。使用 bwa (v 2.2.1 [3]) 将 read 与猴痘参考基因组 (DQ011157 [2]) 进行比对。在 3000 和 300 个猴痘基因组拷贝下观察到了高水平的基因组覆盖（表 3），在无猴痘起始拷贝的情况下没有观察到基因组覆盖。

表 3. xGen 猴痘病毒扩增子探针组支持在一系列病毒 DNA 起始量下进行覆盖。

超级扩增子有助于在存在突变的情况下保持测序覆盖性能

图 4. 尽管引物结合位点发生突变，xGen 猴痘病毒扩增子探针组仍保持基因组覆盖性能。 超级扩增子 (super amplicon) 的产生意味着即使在引物结合位点发生突变的情况下（此处用黑色箭头表示），xGen 猴痘病毒扩增子探针组也可以保持基因组覆盖性能。文库制备的起始材料包括约 3000 个拷贝的猴痘基因组 (BEI Resources) 和 10 ng Coriell DNA NA12878（人）。在 MiniSeq 系统 (Illumina) 上对所得 NGS 文库进行测序（150 bp PE 测序），生成 1,774,058 总 read。使用 bwa (v 2.2.1 [3]) 将 read 与猴痘参考基因组 (DQ011157 [2]) 进行比对，并用 IGV (Broad Institute [4]) 对覆盖情况进行了可视化。

订购信息

xGen™ Amplicon Core Kit

xGen™ Monkeypox Virus Amplicon Panel

xGen™ Amplicon UDI Primers

xGen™ PEG NaCl Buffer

xGen™ Amplicon CDI Primers

参考文献

1. Antwerpen MH, Lang D, Zange S, et al. First German genome sequence of Monkeypox virus associated to multi-country outbreak in May 2022. 2022.
2. Likos AM, Sammons SA, Olson VA, et al. A tale of two clades: monkeypox viruses. J Gen Virol. 2005;86(Pt 10):2661-2672.
3. Li H. and Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 2009; 25:1754-60.
4. Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. Jan 2011;29(1):24-6. doi:10.1038/nbt.1754