xGen™ 杂交和洗涤 v2试剂盒旨在与xGen杂交探针组和xGen通用封闭剂搭配使用。该试剂盒包含两种用以执行杂交捕获工作流程的核心组分：xGen杂交和洗涤v2试剂与xGen杂交和洗涤v2磁珠。该试剂盒的最新版包含一个新的、内部开发的 xGen 2x HiFi PCR 预混合液，与用于 NGS 靶向富集的 DNA 文库 xGen 杂交捕获实验方案兼容，为靶向 NGS 研究提供完整、高质量的杂交捕获解决方案。

在您的杂交捕获反应中使用xGen通用封闭剂可防止接头交叉杂交。在富集前，接头序列会连接至所有文库片段，包括中靶片段和脱靶片段。这些接头序列在富集过程中可彼此杂交，因而产生“daisy-chain”效应，导致脱靶片段与中靶片段一同被捕获，从而会影响测序效率。

xGen 通用封闭剂结合到平台接头序列的指定链上（通常为合成接头的反链），以帮助防止非特异性结合。封闭接头序列可显著提升捕获结果。

自动化

我们已与多家仪器供应商合作，以开发适用于在液体处理机器人上进行 xGen 杂交捕获实验方案研究的自动化脚本。目前可提供适用于以下工作站的脚本：

• Beckman Coulter Biomek™ i5 和 i7 自动化工作站

• Hamilton NGS STAR™ 文库制备工作站

• Perkin Elmer Sciclone™ 工作站

请联系仪器供应商了解是否有脚本以及脚本安装情况，或联系 IDT 客户服务部门获取用于液体处理机器人的合格自动化脚本的更新列表。

产品优势

• 配合各种 xGen 杂交探针组实现均一的覆盖和可靠的捕获功能

• 以便捷的工作流程生成靶向 NGS 数据

• 经过更新的自动化实验方案，支持各种通量水平的实验

• xGen 通用封闭剂通过专有序列修饰，有效封闭各种标签接头设计，从而提高中靶结果

• xGen 2x HiFi PCR 混合液现已包含在内，因此无需从多个供应商处采购组分

产品数据

自动与手动工作流程（管装和板装）可实现相当的均一序列覆盖。

图 1. 不受杂交探针组工作流程、形式和类型影响的一致覆盖。 在 Biomek i 系列 i7 自动化平台上，使用 xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备 v2 机械剪切试剂盒（n = 96，平均剪切大小约 150 bp），由 100 ng Coriell NA24385 起始 DNA 制备所有文库。随后使用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组 (A) 或 xGen 外显子组杂交探针组 v2 (B)，搭配 xGen 杂交和洗涤 v2 试剂盒和 xGen 通用封闭剂，对 DNA 文库进行富集。使用指定的方法（手动或自动）和形式（板装或管装）组合完成文库制备。(A) 用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组进行的杂交捕获，手动/自动（板装/管装）工作流程的覆盖性能相当，每个测试 n = 1。(B) 使用 xGen 外显子组杂交探针组 v2 捕获文库，手动/自动以及板装/管装的覆盖性能相当，每个测试 n =1。(C) 各方法和各探针组具有一致的中靶 %。对于不同的方法，各探针组在单重反应中的重复捕获样本数分别为：n = 18（自动）、n = 16（手动，板装）以及 n = 8（管装）。还使用 Biomek 系列 i7 自动化平台，按照由 IDT 和 Beckman Coulter Life Sciences 联合开发的自动化脚本，根据用于 NGS 靶向富集的 DNA 文库 xGen 杂交捕获实验方案，进行了自动捕获。在 NextSeq™ 2000 仪器上进行测序，以生成 2x150 bp 双端 read。总之，当搭配使用 xGen 杂交和洗涤 v2 试剂盒时，无论使用哪种工作流程方法，均能获得一致的覆盖。使用专有的 xGen 2x HiFi PCR 预混合液（现已包含在 xGen 杂交和洗涤 v2 试剂包中）对文库和捕获进行了扩增。

不用用户、不同日期间具有一致的中靶率

图 2. 96 孔板靶向富集中靶率的日常可重复性和用户间可重现性。 使用 xGen cfDNA & FFPE DNA 文库制备 v2 机械剪切试剂盒由 25 ng 机械剪切 NA12878 gDNA (Coriell) 制备 DNA 文库 (n = 4)。然后，搭配 xGen 通用封闭剂，使用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组对文库进行过夜杂交，使用 xGen 杂交和洗涤 v2 试剂盒进行捕获。使用双端 read 在 NextSeq 500 (IIIumina) 上对样本进行测序，测序至具有 2,000 万 read 对的平均 read 深度，然后截取至 1,500 万 read 对。为了测试用户间可重现性，由多个用户按照 96 孔板的手动实验方案进行目标序列捕获。为了测试日常可重复性，用户 1 分别在三天进行了目标序列捕获。每个数据集的中靶率（150 bp 侧翼序列）为平均值。使用新的、内部研制的 xGen 2x HiFi PCR 混合液（现已包含在 xGen 杂交和洗涤 v2 试剂包中）对文库和捕获进行了扩增。

使用 xGen 通用封闭剂提高中靶率

图 3. 使用 Illumina TruSeq® (A) 和 Illumina Nextera® (B) 接头形式时 xGen 通用封闭剂提高中靶率的示例。 (A) 使用 8 nt 或 10 nt 接头由人基因组细胞系 NA12878 (Coriell) 制备 1 µg 起始 DNA 文库，使用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组在添加 xGen™ 通用封闭剂 TS、xGen™ 通用封闭剂 10bp TS 或不添加封闭剂的条件下对文库进行富集（单重，每个条件下 n = 3）。在 NextSeq 500 系统 (Illumina) 上进行测序，生成 2x150 bp 双端 read。(B) 使用 50 ng 细胞系 NA12878 (Coriell) gDNA 制备 Nextera 文库。使用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组在 4-plex 反应 (n = 3) 中，或使用 xGen 个人识别杂交探针组在 12-plex 反应 (n = 1) 中，在添加 xGen 通用封闭剂 NXT 或不添加封闭剂的条件下富集扩增文库 (n = 1)。在 NextSeq 系统 (Illumina) 上进行测序，生成 2x75 bp 双端 read。两个图中的文库和捕获均使用 KAPA 2x HiFi PCR 混合液进行扩增，因为生成该数据时 xGen 2x HiFi PCR 混合液尚未发布。

使用 xGen 通用封闭剂 10 bp TS 可获得高中靶率和均一覆盖

图 4. 通过添加 xGen 通用封闭剂，在不同水平的多重捕获中获得了一致的覆盖，并提高了中靶率。 (A) 在不同水平的多重样本分析中使用 xGen 通用封闭剂 10bp TS 获得一致结果的示例。使用 xGen AML 癌症基因检测杂交探针组，在单重 (n = 8) 或多重反应 (n = 3) 中对使用细胞系 NA12878 (Coriell) 制备的 DNA 文库（500 ng 起始量/样本）进行富集。使用 10 bp TruSeq 接头和唯一双标签序列构建文库。使用 2x150 bp 双端 read 在 NextSeq 500 系统 (Illumina) 上进行测序。在测试的所有多重水平下覆盖度一致。(B) 通过 xGen 通用封闭剂 10bp TS 提高中靶率的示例。使用 xGen AML 癌症基因检测探针组，联合或不联合 xGen 通用封闭剂 10bp TS，在单重反应 (n = 3) 中对使用细胞系 NA12878 制备的 DNA 文库（500 ng 起始量/样本）进行富集。在 NextSeq 500 系统 (Illumina) 上进行测序，以生成 2x150 bp 双端 read。取各项实验中靶值（150 bp 侧翼序列）的平均值。两个图中的文库和捕获均使用 KAPA 2x HiFi PCR 混合液进行扩增，因为生成该数据时 xGen 2x HiFi PCR 混合液尚未发布。

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