近年来，高通量测序技术已经彻底改变了生物学和医学等学科的研究方式，使得在单碱基水平上对大量样本的核苷酸序列进行检测成为可能。 在科研领域，RNA-Seq是分析基因表达和发现新种类RNA的常用方法；在精准医疗领域，靶向富集，特别是杂交捕获技术已经越来越多地应用于检测RNA水平上的融合突变，而基因融合可能会激活原癌基因、失活抑癌基因，从而驱动肿瘤的发生发展，同时也是很多癌症的微小病灶残留（MRD）靶点。

尽管现有技术方案允许对RNA分子进行直接测序，但大多数RNA-Seq实验使用的是针对于DNA分子的测序平台。因此，从样本中获得纯化后的RNA分子，经过逆转录生成cDNA文库，是RNA-Seq的必要步骤。下面我们就来讨论IDT埃德特分别针对科学研究及临床检测领域的RNA-seq测序解决方案及其关键性能参数。

科研领域

聚腺苷酸化（Poly A）RNA 测序可能是RNA-Seq中常见的应用之一。由于在真核生物中，大多数编码蛋白的RNA （mRNA）和一些长链非编码RNA （lncRNA）（>200 nt）都含有poly（A）尾，这为从总细胞RNA中富集含有poly（A）尾RNA提供了技术便利，比如可以选择锚链oligo-dT分子的磁性或纤维素珠进行富集^[1]。

非聚腺苷酸化RNA-seq流程主要应用于原核mRNA、FFPE样品中的片段化mRNA等。针对以上所述种类的RNA-seq，其主要问题在于如何消除核糖体RNA （rRNA），这也是细胞中含量丰富、少有关注的RNA种类。去除提取样本总RNA中的rRNA方法包括：

1.基于可以与rRNA序列杂交的序列特异性探针，经过与生物素标记的DNA或锁核酸 （LNA）探针杂交，使用链霉亲和素磁珠将其去除；

2.设计与rRNA序列互补的反义DNA寡核苷酸，之后使用RNase H酶进行消化。

在常规的RNA-Seq文库制备流程中，直接使用随机六聚体引物扩增生成的双链cDNA为模版进行文库制备，虽然简单可行，但却丢失了RNA水平上的链特异性信息。缺乏链特异性信息的文库，不利于新的RNA种类的检出以及RNA表达水平的量化^[1]。

IDT埃德特所独有的Adaptase专利技术，允许同时在单链DNA上进行加尾和接头连接反应。高效率、不依赖模板的Adaptase反应，可降低碱基偏好性并提升文库覆盖程度。该技术已经应用到多种IDT埃德特文库构建试剂盒中，包括xGen™ Broad-range RNA Library Prep（左图）及xGen™ RNA Library Prep（右图）。两款RNA建库试剂盒均能接受较为宽泛的样本起始量，并有着高质量、优秀的测序数据产出，深化、加速您的RNA-seq研究。常规的RNA文库构建流程中需要将合成的第二链cDNA中加入互补配对的“U”碱基，后续含有“U”碱基模板被消化或无法扩增，以便最终得到链特异性文库。IDT埃德特独家提供的RNA建库试剂盒则借助Adpatase技术，利用第一链cDNA模版，可以构建链特异性RNA文库，无需常规的第二链cDNA合成。

稳定的文库产出，极低比例引物&接头二聚体

IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep由于使用专利的Adaptase^®技术，无需第二链cDNA合成及接头浓度稀释。即便对于低起始量及降解样本，仍可保证高连接及转化效率，有着更低的接头二聚体比例。在同等RNA起始量的情况下，与另一品牌试剂盒相比(右图)，xGen™ Broad-range RNA Library Prep文库质量更高。

更高的Mapping率、更多转录本检出、更低的Dup率

使用IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep构制备的RNA文库，在各项测序指标都具有优势：更高的Mapping率、更多的基因和转录本检出、更低的Dup率。即使在样本起始量较低情况下(10 ng总RNA用于PolyA富集），仍可得到高质量测序数据，可让您即便面对具有挑战性的样本，仍可得到理想的实验结果。

更低的起始量要求，更均一的转录本覆盖度

即使样本起始量较低情况下（10 ng总RNA用于PolyA富集，100 pg mRNA），IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep也可保证转录本覆盖度的均一性，从而提升了有效的转录组注释。

不同起始量对比，高重复性的转录本检出

在不同样本起始量的重复实验中，IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep保证了转录本检出和表达结果高度一致性。

精准医疗领域

基因融合（Fusion gene）是一类与肿瘤发生发展高度相关的基因变异形式。融合基因主要由染色体易位、缺失或倒位导致，表现为两个不同基因的部分序列或全部序列融合到一起，其表达产物为融合转录本。发生融合的基因往往是癌症驱动基因。当调控细胞增殖、分化和凋亡的基因发生融合，可能直接影响下游信号传递，结果导致细胞增殖能力增强、凋亡与分化出现障碍，最终引起癌症的发生。

基因融合与癌症密切相关，因此深入研究基因融合的发生对于探究癌症发生发展的机理具有重要意义。此外，虽然基因融合的发生率相对于其他种类的突变类型较低，但相关靶向药物的疗效却很显著。FDA或NMPA针对ALK、ROS1、RET、FGFR2和NTRK1/2/3等融合靶点已经批准了多款相应的靶向药物。随着伴随诊断的重要性不断提升，NGS方法学逐步成为分子检测的重要手段。针对不同适应症，国内外专家在NCCN指南、CSCO指南及专家共识中不约而同地提及RNA-seq检测基因融合的必要性，如：NCCN指南在中枢神经系统癌症中推荐使用RNA-Seq为检测RELA与BRAF基因融合的手段；CSCO指南在对于肺癌脑转移的病理诊断，推荐分子检测层面推荐进行ALK融合及ROS融合等基因检测，RNA-Seq为检测手段之一^[2,3]。

融合基因的NGS检测，既可以采用DNA-Seq，也可以采用RNA-seq。如下图列出几种情况，在设计融合基因突变检出实验时，更建议使用RNA-seq或杂交捕获进行检测：

1.一些临床相关的重排事件发生在区域较大的内含子中，需要更多捕获探针进行覆盖及测序数据量。像MSK-IMPACT等基于DNA样本类型的捕获设计，并没有纳入NTRK3和NRG1基因中某些重要内含子，仅仅是因为它们区域太大（每个>90 Kb）；

2.融合事件发生在内含子区域，面对另外一个难题在于通常包含高度重复序列或者复杂的基因组事件，这也增加杂交捕获设计的难度。对于ROS1的内含子31尤其如此，因为它包含两个长散在重复序列（LINE），许多基于DNA的分析，包括MSK-IMPACT，都未能很好地覆盖该内含子；

3.DNA水平的突变检出（特别是低频突变），更容易受肿瘤组织样本身纯度影响^[4]。

图片来源：Kurtis D Davies, et al. Clin Cancer Res. 2019^[2]

IDT埃德特xGen™ Broad-range RNA Library Prep搭配IDT埃德特杂交捕获探针（xGen™ Exome Hyb Panel），可以为低至100pg FFPE RNA样本提供从RNA建库到文库富集全流程解决方案。使用10、100ng不同降解程度FFPE样本（DV200：54-73%），对比无降解的RNA标准品 （含有10种人类细胞系），低质量FFPE样本仍有着高质量的测序指标（高mapping率及外显子率等）。

参考文献：

[1]. Radmila Hrdlickova, et al. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017 Jan;8(1):10.1002/wrna.1364.

[2].NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology, Central Nervous System Cancer (2021 Version 2) [DB/OL]. http://www.nccn.org. 

[3].中国临床肿瘤学会指南工作委员会. 中国临床肿瘤学会（CSCO）中枢神经系统转移性肿瘤诊疗指南[M]. 2021 V1. 北京: 人民卫生出版社, 2021.

[4].Kurtis D Davies, et al. Wake Up and Smell the Fusions: Single-Modality Molecular Testing Misses Drivers. Clin Cancer Res. 2019 Aug 1;25(15):4586-4588.